RNAi原理及演示_Medicilon

来自 : 发布时间：2024-05-06

1 RNAi的机制RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(smallinterfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponentnuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.RNA酶 是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶 家族的一个成员.Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶 结构域，一个双链RNA结合位点.在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应.因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统.研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNApolymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增.双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA.小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代.mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解.更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态.由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同.另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链.结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA.这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制.RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应.RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果.dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围.RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代2 双链RNA的构建双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短.而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用.构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶 指导RNA的合成.因为RNA多聚酶 有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶 遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾.U6启动子能被RNA多聚酶 识别，合成出RNA. Sui et al用Bluescript作为载体，RNA多聚酶 可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中.然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2.他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA.片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止.而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi.RNA多聚酶 亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA.将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体.用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA.在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶.腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.